Методи визначення чутливості до антибіотиків

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків та інших хіміопрепаратів визначають двома групами способів: диско-дифузним (метод дифузії в агар із застосуванням паперових дисків з антибіотиками) та шляхом розведень антибіотика в щільному або рідкому поживному середовищі. Вибір методу залежить від мети дослідження та можливостей лабораторії.

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків та інших хіміотерапевтичних препаратів необхідно визначати в кожному випадку інфекції та періодично – під час лікування. Головним показником чутливості є мінімальна інгібуюча концентрація - МІК (мкг/мл), т.е. е. мінімальна концентрація антибіотика, що затримує зростання мікроба-збудника у стандартному досвіді. Значення величини МІК визначають методом серійних розведень або методом дифузії агар (дисками або Е-тестами). У будь-якому випадку критерієм чутливості є значення величини терапевтичного індексу: Т = МІК/К, де К - концентрація даного антибіотика (мкг/мл) в осередку інфекції (або крові) при введенні терапевтичних доз препарату.

Мікроб чутливий, а антибіотик зазвичай клінічно ефективний при Т<0,3. Значення До можна знайти у спеціальних таблицях.

На практиці величина МІК дозволяє віднести випробуваний штам мікроорганізму до однієї з трьох категорій: чутливої, помірно-стійкої, стійкої.

Мікроорганізм вважають чутливим, якщо він не має механізмів резистентності до даного антимікробного засобу і при лікуванні стандартними дозами інфекції, викликаної цим мікроорганізмом, відзначається хороша терапевтична ефективність.Стійким до антимікробного засобу вважають мікроорганізм, якщо він має механізми резистентності до даного препарату та при лікуванні інфекцій, викликаних цим мікроорганізмом, немає клінічного ефекту навіть при використанні максимальних терапевтичних доз препарату. До помірно-стійких відносять мікроорганізм, якщо за своєю чутливістю він займає проміжне значення між чутливими та стійкими штамами та при лікуванні інфекцій, викликаних даним збудником, хороша клінічна ефективність спостерігається лише при використанні високих терапевтичних доз препарату (або при локалізації процесу у місцях концентрації антимікробного) , наприклад, сечі при сечових інфекціях).

Методом серійних розведень МІК визначають за мінімальною концентрацією антибіотика, що затримує видиме зростання мікроба в пробірках або чашках з живильним середовищем, що містять концентрації антибіотика, що зменшуються. Наприклад, для визначення МІК тетрацикліну щодо культури Staphylococcus aureus, виділеної від хворого, у ряді пробірок готують дворазово спадають концентрації цього антибіотика в стандартному поживному бульйоні, для чого вміст пробірки перемішується і переноситься 1 мл з 2-ї пробірки в 3-ю, 3-й - до 4-ї і т.д. д., та якщо з останньої пробірки 1 мл видаляється (таблиця).

Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків (МІК, мкг/мл) методом серійних розведень у бульйоні.

Номер дослідної пробірки (кінцева концентрація антибіотика мкг/мл)

1 2 3 4 5 (64) (32) (16) (8) (4)

2. Розчин антибіотика (64 мкг/мл), мл

3. Випробувана культура/стандартизована суспензія

Інкубування в оптимальних для культури умовах 18-24 год.

Інтерпретація результату: МІК тетрацикліну щодо випробуваної культури - 16 мкг/мл.

Обліковою ознакою є наявність або відсутність мутантності бульйону в пробірках. У контролі культури має бути мутантність, у решті контролю - немає. Величина МІК відповідає тій мінімальній концентрації, за якої відсутня каламутність (бульйон у пробірках прозорий). Так, якщо бульйон буде каламутним у 4-й чи 5-й дослідних пробірках, МІК тетрацикліну = 16 мкг/мл. Відомо, що величина тетрацикліну До введення середньотерапевтичних доз - 2 мкг/мл (при використанні максимальних доз - 10 мкг/мл). Отже, в даному випадку терапевтичний індекс дорівнюватиме Т = 16 /₂ = 8 (> 0,3), тобто збудник стійкий до антибіотику та лікування тетрацикліном не дає антимікробного ефекту щодо Staphylococcus aureus у даного хворого навіть при введенні максимальних доз (Т = 16/₁₀ = 1,6).

Метод серійних розведень вважається найточнішим, але щодо трудомістким.

При визначенні чутливості методом дифузії в агар чисту культуру збудника засівають «газоном» на поживній агар у чашці, наприклад, тампоном, змоченим у стандартизованій (10 8 КУО/мл) суспензії мікроорганізму. Потім на поверхню агару укладають стандартні паперові диски, просочені антибіотиками, які дифундують агар, створюючи градієнт концентрації. На чашку діаметром 90 мм рівномірно укладають трохи більше шести дисків з певною кількістю антибіотика. Після інкубування термостаті вимірюють діаметри зон затримки зростання навколо дисків і за спеціальними таблицями визначають ступінь чутливості до того чи іншого антибіотика. Кожному значенню діаметра зони навколо диска з антибіотиком відповідає певне значення МІК.Виходячи з цих значень, для кожного антибіотика розраховані величини терапевтичного індексу, що дозволяє по діаметру зони визначити ступінь чутливості до того чи іншого антибіотика: чутливі (S), помірно-стійкі (I) та стійкі (R). До категорії S (від англійської sensitive - чутливий) відносять ті, котрим використання середніх терапевтичних доз буде достатнім для триразового перевищення МІК. До категорії I (від англійської intermediate - проміжний) відносять ті мікроби, для придушення яких знадобляться максимальні терапевтичні дози. Категорію R (від англійської resistant - стійкий) становлять ті мікроорганізми, щодо яких цей антибіотик буде неефективним in vivo.

Метод визначення чутливості за допомогою Е-тестів. Останні являють собою паперові смужки, просочені не однією, а поряд зменшуваних концентрацій певного антибіотика (128, 64, 32, 16, 8, 4 мкг/мл). Е-тести укладають на поверхню стандартного живильного агару, засіяного випробуваною культурою у вигляді газону. Після інкубування навколо смужки формується еліпсоподібна зона затримки росту, яка звужується в області малих концентрацій і перетинає смужку на рівні, відповідному величині МІК.

Метод серійних розведень у планшетах. Використовують готові стерильні полістиролові 96-лункові планшети, в лунки яких внесені і ліофільно висушені концентрації антибіотиків у бульйоні. Після розкриття планшета стандартизовану суспензію випробуваної культури в однаковій дозі (наприклад, 0,1 мл) асептично вносять у відповідні ряди лунок, закривають кришкою та інкубують при оптимальній температурі.Середовище при цьому відновлюється, що дозволяє після інкубування планшета відзначити зростання (помутніння бульйону) у тих лунках, де антибіотик не діє. При помутнінні бульйону у контролі культури та дослідних лунках визначають величину МІК. Облік можна вести як візуально, і з допомогою спеціальних мікробіологічних аналізаторів.

Метод прикордонних концентрацій вважатимуться усіченим методом серійних розведень. Відповідно до нього випробувану культуру вносять тільки дві лунки (пробірки), де знаходяться висока (З) і низька (с) концентрації антибіотика. Концентрація З відповідає межі між стійкими та помірно-стійкими штамами, а концентрація з - межі між помірно-стійкими та чутливими штамами. Якщо після інкубування зростання відсутнє в обох лунках, штам відносять до чутливих, якщо тільки в лунці з концентрацією С - до помірно стійких штамів, а якщо в обох лунках є зростання, штам відносять до стійких.

Важливими умовами є:

• - використання лише чистих культур та дотримання правил асептики;
• - Застосування стандартних поживних середовищ, відповідних поживним потребам випробуваного мікроорганізму (середовища Мієллера-Хінтона, агар АГВ, середовище НТМ та ін);
• - внесення випробуваної культури у стандартній дозі та дотримання встановленого співвідношення інокулюм/середовище;
• - правильний режим інкубування та метод обліку.

Чутливість до антибіотиків бажано перевіряти у свіжовиділених культур, виділених з матеріалу до початку антибіотикотерапії, та повторювати дослідження з культурами, виділеними під час лікування.

Останніми роками на практиці почали застосовувати ПЛР виявлення у мікробів специфічних генів, відповідальних формування лікарської стійкості (геноиндикация антибиотикоустойчивых культур).

ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ ДО АНТИБІОТИКІВ:
МЕТОДИ, РЕЗУЛЬТАТИ, ОЦІНКА

Решедька Галина Костянтинівна,
к.м.н., асистент кафедри клінічної фармакології
Смоленської державної медичної академії
214019, м.Смоленськ, вул.Крупської, 28, а/с № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: [email protected]

Резюме

У лекції розглянуто основні методи визначення чутливості in vitro мікроорганізмів до антимікробних препаратів (диско-дифузійний, Е-тестів, методи розведення). Відображено підходи до емпіричного та етіотропного призначення антибіотиків у клінічній практиці. Обговорено питання інтерпретації результатів визначення чутливості з клінічної та мікробіологічної точок зору.

В даний час у клінічній практиці існують два принципи призначення антибактеріальних препаратів: емпіричне та етіотропне. Емпіричне призначення антибіотиків засноване на знаннях про природну чутливість бактерій, епідеміологічних даних про резистентність мікроорганізмів у регіоні або стаціонарі, а також результати контрольованих клінічних досліджень. Безперечною перевагою емпіричного призначення хіміопрепаратів є можливість швидкого початку терапії. Крім того, за такого підходу виключаються витрати на проведення додаткових досліджень.

Однак при неефективності антибактеріальної терапії, що проводиться, при нозокоміальних інфекціях, коли важко припустити збудника і його чутливість до антибіотиків прагнуть проводити етіотропну терапію. Етіотропне призначення антибіотиків передбачає як виділення збудника інфекції з клінічного матеріалу, а й визначення його чутливості до антибіотиків. Отримання коректних даних можливе лише за грамотного виконання всіх ланок бактеріологічного дослідження: від взяття клінічного матеріалу, транспортування їх у бактеріологічну лабораторію, ідентифікації збудника до визначення його чутливості до антибіотиків та інтерпретації отриманих результатів.

Друга причина, що обумовлює необхідність визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів – це отримання епідеміологічних даних про структуру резистентності збудників позалікарняних та нозокоміальних інфекцій. У практиці ці дані використовують при емпіричному призначенні антибіотиків, а також для формування лікарняних формулярів.

Методи визначення чутливості до антибіотиків

Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків діляться на 2 групи: дифузійні та методи розведення.

дифузійні методи
• з використанням дисків з антибіотиками
• за допомогою Е-тестів

методи розведення
• розведення в рідкому живильному середовищі (бульйоні)
• розведення в агарі

При визначенні чутливості диско-дифузійним методом на поверхню агару в чашці Петрі наносять бактеріальну суспензію певної щільності (зазвичай еквівалентну стандарту каламутності 0,5 McFarland) і потім поміщають диски, що містять певну кількість антибіотика. Дифузія антибіотика в агарі призводить до формування зони придушення зростання мікроорганізмів навколо дисків. Після інкубації чашок у термостаті при температурі 35 про -37 про С протягом ночі враховують результат шляхом вимірювання діаметра зони навколо диска в міліметрах (рис. 1).

Малюнок 1. Визначення чутливості мікроорганізмів диско-дифузійним методом.

Визначення чутливості мікроорганізму за допомогою Е-тесту проводиться аналогічно до тестування диско-дифузійним методом. Відмінність полягає в тому, що замість диска з антибіотиком використовують смужку Е-тесту, що містить градієнт концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної (рис. 2). У місці перетину еліпсоподібної зони пригнічення росту зі смужкою Е-тесту набувають значення мінімальної переважної концентрації (МПК).

Малюнок 2. Визначення чутливості мікроорганізмів за допомогою Е-тестів.

Безперечною перевагою дифузійних методів є простота тестування та доступність виконання у будь-якій бактеріологічній лабораторії. Однак з урахуванням високої вартості Е-тестів для рутинної роботи зазвичай використовують диско-дифузійний метод.

Методи розведення засновані на використанні подвійних послідовних розведень концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної (наприклад від 128 мкг/мл, 64 мкг/мл і т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл і 0,125 мкг/мл) .При цьому антибіотик у різних концентраціях вносять у рідке живильне середовище (бульйон) або в агар. Потім бактеріальну суспензію певної щільності, відповідну стандарту каламутності 0,5 MсFarland, поміщають у бульйон з антибіотиком або на поверхню агару в чашці. Після інкубації протягом ночі при температурі 35 -37 про С проводять облік отриманих результатів. Наявність зростання мікроорганізму в бульйоні (помутніння бульйону) чи поверхні агару свідчить у тому, що ця концентрація антибіотика недостатня, щоб придушити його життєздатність. У міру збільшення концентрації антибіотика зростання мікроорганізму погіршується. Першу найменшу концентрацію антибіотика (із серії послідовних розведень), де візуально не визначається бактеріальне зростання прийнято вважати мінімальною переважною концентрацією (МПК). Вимірюється МПК мг/л або мкг/мл (рис. 3).

Малюнок 3. Визначення значення МПК методом розведення в рідкому поживному середовищі.

Інтерпретація результатів визначення чутливості

На підставі одержуваних кількісних даних (діаметра зони придушення зростання антибіотика або значення МПК) мікроорганізми поділяють на чутливі, помірно резистентні та резистентні (рис. 4). Для розмежування цих трьох категорій чутливості (або резистентності) використовують так звані прикордонні концентрації (breakpoint) антибіотика (або прикордонні значення діаметра зони пригнічення мікроорганізму росту).

Малюнок 4. Інтерпретація результатів визначення чутливості бактерій відповідно до значень МПК.

Прикордонні концентрації є незмінними величинами. Вони можуть переглядатися залежно від зміни чутливості популяції мікроорганізмів. Розробкою та переглядом критеріїв інтерпретації займаються провідні фахівці (хіміотерапевти та мікробіологи), які входять до спеціальних комітетів. Одним із них є Національний комітет з клінічних лабораторних стандартів США (NCCLS). В даний час стандарти NCCLS визнані у світі та використовуються як міжнародні для оцінки результатів визначення чутливості бактерій при багатоцентрових мікробіологічних та клінічних дослідженнях.

Існують два підходи до інтерпретації результатів визначення чутливості: мікробіологічний та клінічний. Мікробіологічна інтерпретація ґрунтується на аналізі розподілу значень концентрацій антибіотика, що пригнічують життєздатність бактерій. Клінічна інтерпретація ґрунтується на оцінці ефективності антибактеріальної терапії.

Чутливі мікроорганізми (susceptible)

Клінічно до чутливих відносять бактерії (з урахуванням параметрів, отриманих in vitro), якщо при лікуванні стандартними дозами антибіотика інфекцій, що викликаються цими мікроорганізмами, спостерігають добрий терапевтичний ефект.

За відсутності достовірної клінічної інформації підрозділ на категорії чутливості базується на сумісному обліку даних, отриманих in vitro, та фармакокінетики, тобто. на концентраціях антибіотика, досяжних у місці інфекції (або сироватці крові).

Резистентні мікроорганізми (resistant)

До резистентних (стійких) відносять бактерії, коли при лікуванні інфекції, викликаної цими мікроорганізмами, немає ефекту від терапії навіть за використання максимальних доз антибіотика. Такі мікроорганізми мають механізми резистентності.

Мікроорганізми з проміжною резистентністю (intermediate)

Клінічно проміжну резистентність у бактерій мають на увазі у разі, якщо інфекція, спричинена такими штамами, може мати різний терапевтичний результат. Однак лікування може бути успішним, якщо антибіотик використовується у дозуванні, що перевищує стандартну, або інфекція локалізується у місці, де антибактеріальний препарат накопичується у високих концентраціях.

З мікробіологічної точки зору до бактерій з проміжною резистентністю відносять субпопуляцію, що знаходиться відповідно до значень МПК або діаметра зон, між чутливими та резистентними мікроорганізмами. Іноді штами з проміжною резистентністю та резистентні бактерії поєднують в одну категорію резистентних мікроорганізмів.

Слід зазначити, що клінічна інтерпретація чутливості бактерій до антибіотиків є умовною, оскільки результат терапії який завжди залежить лише від активності антибактеріального препарату проти збудника. Клініцистам відомі випадки, коли за резистентності мікроорганізмів, за даними дослідження in vitro, отримували добрий клінічний ефект. І навпаки, за чутливості збудника може спостерігатися неефективність терапії.

У певних клінічних ситуаціях, коли недостатньо результатів дослідження чутливості звичайними методами визначають мінімальну бактерицидну концентрацію.

Мінімальна бактерицидна концентрація (МБК) - найменша концентрація антибіотика (мг/л або мкг/мл), що при дослідженні in vitro спричиняє загибель 99,9% мікроорганізмів від вихідного рівня протягом певного періоду часу.

Значення МБК використовують при терапії антибіотиками, що мають бактеріостатичну дію, або за відсутності ефекту від антибактеріальної терапії у особливої ​​категорії хворих. Окремими випадками для визначення МБК можуть бути, наприклад, бактеріальний ендокардит, остеомієліт або генералізовані інфекції у пацієнтів з імунодефіцитними станами.

На закінчення хотілося б відзначити, що на сьогоднішній день не існує методів, які б з абсолютною достовірністю прогнозувати клінічний ефект антибіотиків при лікуванні інфекційних хвороб. Однак, дані результатів визначення чутливості можуть бути хорошим орієнтиром клініцистам для вибору та корекції антибактеріальної терапії.

Таблиця 1. Критерії інтерпретації чутливості бактерій

Література

1. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9.- 1999.- V.19.- N.1.
2. Методи для визначання susceptibility bacteria to antimicrobial agents. EUCAST Definitive document // Clin Microbiol Infect.- 1998.- V.4.- P.291-296.

Методи визначення чутливості до антибіотиків

Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків діляться на 2 групи: дифузійні та методи розведення.

Визначення чутливості бактерій до антибіотиків:

з використанням дисків з антибіотиками

розведення в рідкому живильному середовищі (бульйоні)

При визначенні чутливості диско-дифузійним методом на поверхню агару в чашці Петрі наносять бактеріальну суспензію певної щільності (зазвичай еквівалентну стандарту каламутності 0,5 McFarland) і потім поміщають диски, що містять певну кількість антибіотика. Дифузія антибіотика в агарі призводить до формування зони придушення зростання мікроорганізмів навколо дисків. Після інкубації чашок у термостаті при температурі 35 про -37 про С протягом ночі враховують результат шляхом вимірювання діаметра зони навколо диска в міліметрах (рис. 1).

Малюнок 1. Визначення чутливості мікроорганізмів диско-дифузійним методом.

Визначення чутливості мікроорганізму за допомогою Е-тесту проводиться аналогічно до тестування диско-дифузійним методом. Відмінність полягає в тому, що замість диска з антибіотиком використовують смужку Е-тесту, що містить градієнт концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної (рис. 2). У місці перетину еліпсоподібної зони пригнічення росту зі смужкою Е-тесту набувають значення мінімальної переважної концентрації (МПК).

Малюнок 2.Визначення чутливості мікроорганізмів за допомогою Е-тестів.

Безперечною перевагою дифузійних методів є простота тестування та доступність виконання у будь-якій бактеріологічній лабораторії. Однак з урахуванням високої вартості Е-тестів для рутинної роботи зазвичай використовують диско-дифузійний метод.

Методи розведення засновані на використанні подвійних послідовних розведень концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної (наприклад від 128 мкг/мл, 64 мкг/мл і т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл і 0,125 мкг/ мл). При цьому антибіотик у різних концентраціях вносять у рідке живильне середовище (бульйон) або в агар. Потім бактеріальну суспензію певної щільності, відповідну стандарту каламутності 0,5 MсFarland, поміщають у бульйон з антибіотиком або на поверхню агару в чашці. Після інкубації протягом ночі при температурі 35 -37 про С проводять облік отриманих результатів. Наявність зростання мікроорганізму в бульйоні (помутніння бульйону) чи поверхні агару свідчить у тому, що ця концентрація антибіотика недостатня, щоб придушити його життєздатність. У міру збільшення концентрації антибіотика зростання мікроорганізму погіршується. Першу найменшу концентрацію антибіотика (із серії послідовних розведень), де візуально не визначається бактеріальне зростання, прийнято вважати мінімальною переважною концентрацією (МПК). Мінімальна переважна концентрація (МПК) - найменша концентрація антибіотика (мг/л або мкг/мл), яка in vitro повністю пригнічує видиме зростання бактерій.

Малюнок 3. Визначення значення МПК методом розведення в рідкому живильному середовищі.

Інтерпретація результатів визначення чутливості

На підставі одержуваних кількісних даних (діаметра зони придушення зростання антибіотика або значення МПК) мікроорганізми поділяють на чутливі, помірно резистентні та резистентні (рис. 4). Для розмежування цих трьох категорій чутливості (або резистентності) використовують так звані прикордонні концентрації (breakpoint) антибіотика (або прикордонні значення діаметра зони придушення росту мікроорганізму).

Малюнок 4. Інтерпретація результатів визначення чутливості бактерій відповідно до значень МПК.

Прикордонні концентрації є незмінними величинами. Вони можуть переглядатися залежно від зміни чутливості популяції мікроорганізмів. Розробкою та переглядом критеріїв інтерпретації займаються провідні фахівці (хіміотерапевти та мікробіологи), які входять до спеціальних комітетів. Одним із них є Національний комітет з клінічних лабораторних стандартів США (NCCLS). В даний час стандарти NCCLS визнані у світі та використовуються як міжнародні для оцінки результатів визначення чутливості бактерій при багатоцентрових мікробіологічних та клінічних дослідженнях.

Існують два підходи до інтерпретації результатів визначення чутливості: мікробіологічний та клінічний. Мікробіологічна інтерпретація ґрунтується на аналізі розподілу значень концентрацій антибіотика, що пригнічують життєздатність бактерій. Клінічна інтерпретація ґрунтується на оцінці ефективності антибактеріальної терапії.

Чутливі мікроорганізми (susceptible)

Клінічно до чутливих відносять бактерії (з урахуванням параметрів, отриманих in vitro), якщо при лікуванні стандартними дозами інфекцій, що викликаються цими мікроорганізмами, антибіотика спостерігають хороший терапевтичний ефект.

За відсутності достовірної клінічної інформації підрозділ категорії чутливості виходить з спільному обліку даних, отриманих in vitro, і фармакокінетики, тобто. на концентраціях антибіотика, досяжних у місці інфекції (або сироватці крові).

Резистентні мікроорганізми (resistant)

До резистентних (стійких) відносять бактерії, коли при лікуванні інфекції, викликаної цими мікроорганізмами, немає ефекту від терапії навіть за використання максимальних доз антибіотика. Такі мікроорганізми мають механізми резистентності.

Мікроорганізми з проміжною резистентністю (intermediate)

Клінічно проміжну резистентність у бактерій мають на увазі у разі, якщо інфекція, спричинена такими штамами, може мати різний терапевтичний результат. Однак лікування може бути успішним, якщо антибіотик використовується у дозуванні, що перевищує стандартну, або інфекція локалізується у місці, де антибактеріальний препарат накопичується у високих концентраціях.

З мікробіологічної точки зору до бактерій з проміжною резистентністю відносять субпопуляцію, що знаходиться відповідно до значень МПК або діаметра зон, між чутливими та резистентними мікроорганізмами. Іноді штами з проміжною резистентністю та резистентні бактерії поєднують в одну категорію резистентних мікроорганізмів.

Слід зазначити, що клінічна інтерпретація чутливості бактерій до антибіотиків є умовною, оскільки результат терапії який завжди залежить лише від активності антибактеріального препарату проти збудника. Клініцистам відомі випадки, коли при резистентності мікроорганізмів, за даними дослідження in vitro, отримували добрий клінічний ефект. І навпаки, за чутливості збудника може спостерігатися неефективність терапії.

Сподобалася стаття? Додай її в закладку (CTRL+D) і не забудь поділитися з друзями: